近年来，过氧化氢蒸汽灭菌技术越来越受无菌制药界的重视。但是，统观国内绝大多数的过氧化氢蒸汽灭菌技术应用案例，不难发现众多过氧化氢蒸汽灭菌技术开发商或者使用者对过氧化氢灭菌技术及过氧化氢的灭菌验证的认识存在一定的误区。

一，过氧化氢灭菌效果的要求

灭菌是指杀灭细菌及其细菌繁殖体、芽孢、病毒和真菌孢子等一切形式的微生物的过程。它是不能由随后的产品检验和试验来充分证实其结果的特殊过程。国际上，为了量化“无菌”的标准，提出“无菌保证水平”的概念，并以此来评价灭菌的杀灭效果。我国及欧美药典都将无菌保证水平值不大于百万分之一作为最终灭菌产品的无菌保证要求。

关于过氧化氢蒸汽灭菌的灭菌效果的要求，国内外对此一直争论不休。通常而言，国际上将过氧化氢蒸汽的净化处理过程视为“除染”，而不是“灭菌”。因此，要求过氧化氢蒸汽的灭菌效果达到最终灭菌产品的灭菌要求似乎是不太明智的。正是如此，不难发现在国际权威的相关法规和指南上，如表1所示，过氧化氢灭菌效果的要求不是要求该工艺的无菌保证水平值低于SAL(10-6)，而相替代的是达到孢子对数降值为6SLR是足够的。

就应用过氧化氢蒸汽灭菌技术于隔离器或其他设备的而言，“美国注射药物协会”(PDA)第34号技术报告提到：“不与药品直接接触的部件或设备的灭菌要求与直接和药品相接触的部件或设备的灭菌要求是不相同的。通过完全杀灭具有较强抗性的孢子量为103的生物指示剂(相当于杀死5-log或更高的灭菌水平)，能足够保证隔离器内部没有可检测的微生物”。而“美国食品及药物管理局”(FDA)则推荐到，应用过氧化氢蒸汽对无菌制药领域的隔离器进行灭菌，其灭菌能力达到4~6log是比较合适的。

就过氧化氢灭菌水平要求而言，作者认为除了考虑无菌保证水平外，还应考虑实际应用条件、人员安全、环境破坏及灭菌验证方法等条件。目前，过氧化氢蒸汽灭菌应用的场合有洁净室、实验室、疾控中心、航天飞机舱、救护车、传递窗、隔离器、生物安全柜等区域，而这些区域的内部表面并未与药品或产品直接接触。而在应用过氧化氢蒸汽对这些区域进行灭菌的验证过程中，要求该灭菌工艺的非无菌单元概率值(PNSU)低于千分之一是可以接受的。

但是，仅要求过氧化氢蒸汽灭菌处理的效果致使挑战生物指示物的孢子对数降值为6SLR是远远不够的。对于不同灭菌场合或灭菌区域而言，初始生物负载水平参差不齐。而且，也难以保持初始生物负载水平稳定。因此，就特定区域进行过氧化氢蒸汽灭菌的灭菌验证而言，如果初始生物负载的数量及抗性超出预期，那么，最终的非无菌单元概率值(PNSU)是远远高于无菌保证水平值的。

二，生物指示剂

就挑战微生物而言，2010版中国药典提到，过氧化氢蒸汽的灭菌验证的生物指示剂的挑战微生物常选择嗜热脂肪芽胞杆菌的孢子。不仅是因为该类微生物对过氧化氢蒸汽显示相当强的抗性，而且还因该类微生物可有效地减少交叉污染的风险(培养温度在55~60℃)。正是如此，市面上的用于过氧化氢灭菌验证的生物指示剂大多数都选择该细菌孢子作为标准挑战微生物。

目前，就挑战所选择的生物指示剂的孢子量的问题，国内外尚有很多争议。作者认为在微生物致死过程遵循一级动力学的前提下(换言之，过氧化氢的灭菌致死性与挑战微生物数目无关)，过氧化氢灭菌效果的确定与孢子量之间没有必然的联系。过氧化氢蒸汽灭菌工艺的灭菌能力是由“灭菌验证方法”所决定的。因此，而为了达到6SLR的灭菌要求，没有必要选择孢子量为10^6的生物指示剂进行验证。

据研究发现，在同等过氧化氢灭菌条件作用下，相比具有同种孢子但孢子量较低的生物指示剂，较高孢子量的生物指示剂的抗性要高一些。因此，如果选择较高孢子量的生物指示剂进行灭菌工艺开发所获得的灭菌循环是相对“保守”且“过度”的。

市面上适用于过氧化氢蒸汽灭菌验证和监测的生物指示剂多种多样，它们的主要不同之处在于其基底载体的差异。有的是用纸条做载体、有的是玻璃纤维，有的是不锈钢片等等。一些学者认为，鉴于过氧化氢所灭菌区域的表面材质差异，因此应选择目标灭菌区域具备抗性的材质作为挑战指示剂的基底材质。尽管在不同基底材质上的生物指示物的抗性有所差异。但是，事实证明，以所谓的“最差”基底材质进行灭菌工艺开发所获得的灭菌效力与以其他基底材质所获得的结果没有多大的差异。而真正问题的实质在于生物指示剂上的孢子相对于在生物负载的抗性差异。

无容置疑，生物指示剂供应商应提供该指示剂的相应的菌种数目稳定性及抗性数据(D值)。如图1所示，为1999~2005年间Apex实验室公司所生产的生物指示剂的标签上标注的D值与实际应用所测量的D值的对比图。由此可知，生物指示剂供应商所提供的D值数据与实际复核测试所得结果有很大的出入。就指示剂的抗性复核测试而言，即使在生物指示剂供应商同样的灭菌条件下进行抗性测试，但由于与供应商测定的方法的不同或者过氧化氢灭菌设备的差异，最终测试所获得的抗性结果可能与指示剂供应商所提供的D值仍有所差异。那么对生物指示剂的抗性数据进行测试的意义何在?作者认为，对每批的生物指示剂进行抗性测试和孢子计数是比较严谨的做法，通过此测试可追溯并评价不同批次的生物指示剂的抗性差异，并为再验证的灭菌能力的评估提供参考。

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