06
Case Analysis Series
案例解析系列
分子生物实验室PCR核酸去污案例
分子实验室中进行核酸相关实验时，核酸污染是一个常见的问题。核酸污染可能会导致实验失败，如PCR产物扩增错误或无法扩增，或影响测序结果的准确性。
苏州某分子实验室核酸污染，在空气中、操作台等能够检测出核酸片段，尤其是高效过滤器口。梵通生物采用自主生产的气化过氧化氢消毒机联合空调系统消毒专用设备，对该实验室核酸去污服务。实验室面积300平方米，空调系统3套，消毒去污时间为5小时。5小时后，核酸环境取样120个，未有一个核酸阳性。
PS：我们近期处理的PCR分子实验核酸污染案例较多，经过实地勘察，归纳总结出问题主要集中在3个方面
1.设计缺陷
未按照分子实验室的设计原则进行设计和建造。有些分子实验室利用原有的无菌实验室改造而成，只对功能间分区进行了改建，对空调系统没有改造，简单以为无菌的环境就可以，没有考虑到气流流向、压差分布、甚至还利用了回风等。
参考设计原则
01
实验室原则上分为四个单独的工作区域，由扩增前区到扩增后区，包括试剂制备区、样品制备区、扩增区和产物分析区，各区仪器设备及各种物品必须是专用的，且各区完全独立。
02
实验室的气流应从扩增前区流动到扩增后区，不得逆向流动。
03
不同功能的核酸检验工作区应是分隔独立的工作室，并有明显的标志，各区间不能直通，如果区间紧密相连，需安装物品传递窗。
2.操作与管理不当
核酸检测技术有诸多优点，其灵敏度超高，一旦实验人员没有严格按照要求操作极易出现核酸污染，很容易导致假阳性结果，从而影响检测的准确性。
常见污染
01
阳性质控品：较为常见，发生概率在40%~60%之间。以重组质粒作为阳性质控品，发生污染的概率更大。以构建的假病毒或重组病毒作为阳性质控品，参与核酸提取的过程中，也容易发生气溶胶污染。在试剂的配制过程中，接触了污染的容器、移液器、枪头、溶液、核酸气溶胶等，导致试剂被污染。
02
PCR产物：尤其是第一代PCR技术，发生概率在60%以上。PCR产物经反复多次的扩增，其复制量远远超过PCR的检测极限。一个气溶胶所包含的拷贝数可以在10^4~10^6copies，因此即使是极微量的污染也足以造成实验结果假阳性。
3.去除方法和去除剂
部分型号生物安全柜的循环风很容易造成核酸气溶胶的形成，一旦造成污染，将很难清除。而常见的紫外线灯、酒精、碘化物、戊二醛类、季铵盐等虽然能杀菌，但是不能降解核酸，或降解效率较差。次氯酸盐类消毒剂可以一定程度降解核酸，但是腐蚀性强，不能处理精密仪器及金属制品，容易腐蚀移液器吸杆影响tip头气密性。
去除方法
01
操作中暴露环节基本在生物安全柜内进行，安全柜采用的A2型安全柜前窗操作口气流的最低流速为0.5m/s，70%气体通过HEPA过滤器再循环至工作区，30%的气体通过排气口过滤排出。如果在柜内操作有核酸溢出、泄露就会有一部分进入安全柜的回风系统，会污染下一次的样品。所以选择正确的消毒方法极为重要。
02
梵通生物研究了常用消毒方法对金黄色葡萄球菌的杀灭效率，并使用PCR检测方法对杀灭效果的验证。
结果：含氯消毒剂和过氧化氢高水平的消毒方法能够高效破环核酸，而紫外线不能破坏核酸。
